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    普侖司特對GPR17抑制可防TNF-α誘導ATDC5細胞II型膠原降解

    發布日期: 2021-01-11
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    骨關節炎(OA)是常見的關節疾病之一,是關節運動過程中慢性疼痛導致殘疾的主要原因。然而,骨關節炎的發病機制是復雜的,目前仍知之甚少。因此迫切需要開發治療骨關節炎安全有效的策略。通常,骨關節炎的特征是軟骨退化、軟骨細胞凋亡和滑膜慢性炎癥。腫瘤壞死因子-α(TNF-α)是重要的促炎細胞因子之一,參與包括骨關節炎在內的各種慢性炎癥疾病。TNF-α的過度表達促進炎癥,炎癥通過誘導基質金屬蛋白酶(MMP)的產生,特別是MMP-3和MMP-13的產生,在OA的發生和進展中起著至關重要的作用。

    MMP-3和MMP-13負責II型膠原的降解。MMP還抑制SRY相關高遷移率族蛋白9(SOX-9)的表達,SOX-9是一種廣泛公認的參與軟骨形成的轉錄因子。因此,TNF-α是治療骨關節炎常用的治療靶點。干擾素調節因子(IRF)-1是骨關節炎中調節MMP轉錄的另一個關鍵因子。IRF-1的上調增強了MMP-3和MMP-13的表達,從而促進軟骨降解。此外,據報道氧化應激是軟骨細胞凋亡的效應物。活性氧的過量產生誘導JAK2/STAT1途徑的激活,該途徑調節細胞因子、酶和其他與骨關節炎相關因子的表達。

    G蛋白偶聯受體17(GPR17)是G蛋白偶聯受體(GPCRs)超家族的一個孤兒受體。研究表明,GPR17在肺纖維化小鼠模型中可以介導促炎細胞因子如TNF-α的表達。這表明GPR17的阻斷可能是治療炎癥相關疾病的一種有前途的方法。然而,GPR17在OA中的生理功能還沒有研究。有報道稱普侖司特對GPR17信號有抑制作用,被認為是一種合成的GPR17抑制劑,這為研究其在不同細胞中的作用提供了有力的工具。本研究的目的是研究普侖司特是否能通過阻斷GPR17的激活而對II型膠原的降解起到保護作用。

     

     

    基本信息

    題目:

    Inhibition of GPR17 with pranlukast protects against TNF-α-induced loss of type II collagen in ATDC5 cells

    期刊:International Immunopharmacology

    影響因子:3.943

    PMID:32805694 

    通訊作者:楊廣勇

    作者單位:溫州醫科大學附屬臺州醫院

    索萊寶合作產品:

    產品名稱

    產品貨號

    Mouse MMP-13 ELISA KIT

    SEKM-0172

     

    摘 要

     

    骨關節炎(OA)是一種常見的關節疾病,影響著*數百萬的老年人。然而,OA的機制是復雜的,人們對其了解甚少。因此,安全有效的治療策略還有待發展。G蛋白偶聯受體17(GPR17)是一種廣泛分布于中樞神經系統(CNS)的孤兒受體。GPR17已成為治療腦部疾病炎癥的靶點。在這項研究中,作者證明了GPR17在ATDC5細胞中表達,并且在腫瘤壞死因子-α(TNF-α)暴露時增加。作者還發現普侖司特拮抗GPR17可以通過下調細胞內活性氧(ROS)水平和增加超氧化物歧化酶(SOD)對TNF-α的活性而顯著抑制氧化應激。有趣的是,普侖司特治療可防止TNF-α誘導的II型膠原減少。此外,siRNA敲除GPR17可改善TNF-α誘導的II型膠原的降低,這表明GPR17在介導II型膠原損傷中具有重要的作用。普侖司特阻斷GPR17,可抑制基質金屬蛋白酶3(MMP-3)和基質金屬蛋白酶13(MMP-13)的表達,MMP可導致II型膠原的降解。普侖司特還可以抑制JAK2/STAT1/IRF-1信號通路的激活,從而抑制促炎細胞因子和酶的表達。此外,普侖司特挽救了TNF-α誘導的SOX-9表達降低??傊?,這些數據表明GPR17可能是治療OA的潛在靶點。

     
     

    研究內容及結果

     

    1.GPR17在ATDC5細胞中表達

    作者首先評估GPR17是否在ATDC5細胞中表達。為了評價GPR17的表達情況,作者以G422細胞作為陽性對照,因為GPR17在G422細胞中表達較高。圖1A的RT-PCR分析結果顯示,與G422細胞中的表達水平相比,ATDC5細胞中GPR17在基因水平上有良好的表達。同樣,通過Western blot分析,作者證實GPR17在ATDC5細胞中在蛋白水平上高度表達,如圖1B所示。

    圖1

    2.TNF-α增加ATDC5細胞中GPR17的表達

    接下來,作者測定了TNF-α對ARDC5細胞中GPR17表達的影響。圖2A中的結果顯示,與基線相比,三種劑量的TNF-α將GPR17的mRNA水平分別增加到1.7倍、2.3倍和2.8倍。圖2B顯示,經TNF-α處理后,GPR17的蛋白質水平升高到1.6倍、2.1倍和2.5倍??偟膩碚f,TNF-α在基因和蛋白質水平上都表現出很強的促進GPR17表達的能力。

    圖2

    3.普侖司特可降低TNF-α誘導的ATDC5細胞氧化應激

    普侖司特的分子結構如圖3A所示。為了確定普侖司特對TNF-α誘導的氧化應激的影響,作者測定了ROS和SOD的水平。如圖3B所示,TNF-α誘導細胞內ROS水平增加了3.3倍,用5μM和10μM普侖司特處理后,細胞內ROS水平僅增加到2.4倍和1.6倍。同時,TNF-α將SOD活性降至15.6U/100mg蛋白質,而基線時為31.1U/100mg蛋白質。然而,5μM普侖司特將SOD活性提高到23.4U/100mg蛋白質,10μM普侖司特進一步將其提高到29.8U/100mg蛋白質(圖3C),接近基線水平。普侖司特表現出劑量依賴性的抗氧化作用。

    圖3

    4.普侖司特抑制TNF-α誘導的II型膠原減少

    抑制細胞中II型膠原降解是預防和治療OA的普遍靶點。這篇研究中,作者試圖確定普侖司特對TNF-α誘導的II型膠原減少的影響。Col2a1的mRNA水平在單獨暴露于TNF-α時降低到45%,而用5μM和10μM普侖司特處理時,Col2a1的mRNA水平分別上升到68%和92%,結果如圖4A所示。圖4B顯示,與上述相同劑量的普侖司特可使Ⅱ型膠原的蛋白質含量提高到71%和94%,而TNF-α處理組的Ⅱ型膠原的蛋白質含量為51%。

    圖4

    5.GPR17的敲除在基因和蛋白水平上都阻止了TNF-α誘導的II型膠原減少

    普侖司特作為GPR17的公認拮抗劑,其對ATDC5細胞的保護作用可能是通過阻斷GPR17的表達而實現的。為了驗證這一理論,作者使用siRNA沉默GPR17的表達(圖5A)。圖5B和5C的結果顯示,GPR17的敲除對TNF-α誘導的Col2a1基因和II型膠原蛋白的減少具有保護作用。這些發現表明GPR17的表達介導II型膠原的減少。

    在補充材料中,作者檢測了普侖司特對GPR17表達的影響。結果表明,普侖司特在基礎條件下和TNF-α處理下均降低了GPR17在mRNA水平和蛋白水平上的表達。重要的是,作者發現GPR17的過表達消除了普侖司特對Col2a1基因表達和II型膠原蛋白表達的保護作用。這些研究結果表明,普侖司特對TNF-α誘導的II型膠原減少中的有益作用是通過抑制GPR17介導的。

    圖5

    6.普侖司特在ATDC5細胞中可恢復TNF-ɑ誘導的SOX-9的減少

    SOX-9是一種在軟骨形成中起重要作用的轉錄因子。SOX-9的表達對抑制TNF-α誘導的II型膠原降解具有重要作用。如圖6A中所示,TNF-α誘導SOX-9的mRNA水平降低52%,分別用5μM和10μM普侖司特處理后可增加到73%和95%。與單獨TNF-α處理組相比(55%),與上述相同劑量的普侖司特將SOX-9的蛋白質水平分別提高到76%和97%(圖6B)。

    圖6

    7.普侖司特在ATDC5細胞中可降低TNF-ɑ誘導的MMP-3和MMP-13的表達

    由于MMP-3和MMP-13被認為是參與II型膠原降解的重要的酶,因此作者確定了普侖司特對這兩種蛋白表達的影響。圖7A顯示,TNF-α刺激后,MMP-3和MMP-13的mRNA水平分別增加了3.2倍和3.9倍。然而,5μM的普侖司特將MMP-3和MMP-13 mRNA水平分別降低到2.1倍和2.3倍,10μM的普侖司特將MMP-3和MMP-13 mRNA水平分別降低到1.5倍和1.7倍。與之一致的是,圖7B的結果顯示,經TNF-α處理后,MMP-3和MMP-13的蛋白水平上升至342.3pg/mL和645.3pg/mL,高于基線時的89.5pg/mL和139.2pg/mL。同時,5和10μM普侖司特將MMP-3的蛋白水平分別降低到265.7和185.6pg/mL,MMP-13的蛋白水平分別降低到466.9和327.5pg/mL。

    圖7

    8.普侖司特在ATDC5細胞中可抑制TNF-ɑ誘導的IRF-1的表達

    MMP-3和MMP-13受IRF-1的轉錄調控。在這里,作者測定了普侖司特對TNF-α誘導的IRF-1表達的影響。圖8A的結果顯示,TNF-α誘導IRF-1在基因水平上的表達增加了3.2倍,而用5μM和10μM普侖司特處理后,IRF-1的表達分別下降到2.1和1.4倍。如預期一致,圖8B所示,兩劑量的普侖司特分別將IRF-1的蛋白水平降低到1.9倍和1.5倍,相比之下,單獨使用TNF-α處理的IRF-1蛋白水平為2.9倍。后,圖8C的免疫染色結果顯示,單獨TNF-α處理后,IRF-1的表達明顯增加到3.2倍。然而,5μM普侖司特可使IRF-1水平降低到2.2倍,10μM普侖司特可使IRF-1水平進一步降低到1.6倍。

    圖8

    9.普侖司特抑制TNF-α誘導的JAK2/STAT1通路的激活

    JAK2/STAT1通路已被證明在OA中調節細胞因子和MMPs的產生中發揮關鍵作用。這項研究中,作者確定了普侖司特阻斷GPR17是否會抑制JAK2/STAT1通路的激活。如圖9所示,Western Blot分析顯示,與基線相比,TNF-α處理顯著提高了p-JAK2和p-STAT1的水平,約為2.7倍和2.9倍。而5μM普侖司特抑制p-JAK2和p-STAT1的表達,分別為2.1倍和1.9倍。此外,10μM普侖司特進一步將這些值降低到1.5和1.4倍。普侖司特對TNF-α誘導的JAK2/STAT1通路的激活具有較強的抑制作用。

    圖9

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    結 論

    綜上所述,作者的研究提供了新的證據,表明普侖司特通過阻斷GPR17的表達,對TNF-α誘導的II型膠原降解具有保護作用。作者的發現提示GPR17可能是治療OA的一個潛在靶點。然而,還需要更多的試驗來進一步研究GPR17及其拮抗劑對骨關節炎進展和發展的影響。

     

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